Размер:
A A A
Цвет: C C C
Изображения Вкл. Выкл.
Обычная версия сайта
+7 (383) 304 90 04
Новосибирск, Николаева, 12/3
С 9:00 до 18:00, пн-пт

Полностью функциональное замещение утраченного зуба биоинженерным трансплантатом

22 Ноября, 2018

Автор: Proceedings of the National Academy of Sciences, August 11, 2009, vol. 106, no. 32, P. 13475-13480

Идея трансплантации зубов отнюдь не нова – в действительности, еще в древнем Египте рабов понуждали «отдавать» свои зубы фараонам. Однако проблема гистологической совместимости значительно снижала ценность подобной методики. А вот аутотрансплантация (то есть перемещение зуба данного конкретного человека из одной позиции в другую) в большинстве случаев работает достаточно хорошо. Например, у пациента с поврежденным моляром обнаруживается ретинированный или сверхкомплектный моляр – тогда поврежденный зуб можно удалить и успешно заменить на непрорезавшийся.

Но еще никому не удавалась успешная трансплантация зубного зачатка с его последующим развитием в полноценный работоспособный орган.

Значительного (можно сказать, сенсационного) прогресса в этой области добилась группа японских ученых под руководством профессора Takashi Tsuji (Tokyo University of Science). Метод опробован пока только на мышах, однако в будущем, по мнению ученых, он может быть применен и в стоматологической практике. Подробный отчет о результатах исследований опубликован в официальном журнале Национальной академии наук США.

1. Методика

1.1. Конструирование зубного зачатка

В качестве исходного клеточного материала был взят зачаток моляра от эмбриона мыши (14,5 дней); проведена сепарация эпителиальных и мезенхимальных клеток. Затем, используя разработанный ранее 3-D метод клеточных манипуляций (так называемый organ germ method), был создан зачаток биоинженерного зуба (Рис. 1).

Рис. 1. Схематическое представление методики трансплантации, используемой для генерации зубного зачатка

Причём любопытно, что контролируя количество эпителиальных и мезенхимальных клеток в зачатке, можно получать различные зубные структуры. Так, в предыдущих экспериментах соотношение 5*104 эпителиальных и 1*105 мезенхимальных клеток давало в итоге множественный зуб. А в настоящем исследовании удалось стабилизировать условия для выращивания единичной зубной структуры (single bioengineered molar) – по 5*104 клеток.

Инкубационный период in vitro составил 5 дней при 37 °C в специальной культуре, в результате был получен биоинженерный зубной зачаток размером около половины миллиметра (Рис. 2).

Рис. 2. Фазоконтрастный снимок зубного зачатка, пятый день инкубации

1.2. Трансплантация зубного зачатка

Трансплантационной моделью в текущем исследовании являлась область альвеолярного отростка челюстной кости взрослой особи мыши после удаления верхнего первого моляра (Рис. 3).

Рис. 3. Гистологический анализ первого моляра взрослой мыши (слева) и верхней челюсти после его экстракции и залечивания раны в течении 3-х недель (справа) посредством гематоксилин-эозин окрашивания (ГЭ)

С помощью микрохирургических инструментов в костной альвеоле формировалось ложе надлежащего размера, куда и пересаживался зубной зачаток – эксплант (explant) – с соблюдением правильной ориентации (Рис. 1, 4, 5).

Рис. 4. Внутриротовые снимки биоинженерного зуба: a – перед прорезыванием; b – непосредственно после прорезывания; c – полная окклюзия

Рис. 5. Гистологический анализ биоинженерного зуба в процессе прорезывания и окклюзии

2. Прорезывание и окклюзия

Появление бугорка биоинженерного зуба в ротовой полости происходило на 36.7 ± 5.5 день после трансплантации. Вертикальные размеры коронки постоянно увеличивались, и уже на 49.2 ± 5.5 день зуб-эксплант достигал плоскости окклюзионного контакта с антагонистом (нижним первым моляром) (Рис. 6, 7).

Рис. 6. Внутриротовые снимки биоинженерного зуба перед прорезыванием (слева), непосредственно после прорезывания (в центре) и в полной окклюзии (справа): A – под углом в 45° и окклюзионно; B – щечно при смыкании

Рис. 7. Компьютерная томография: A – микро-КТ снимки биоинженерного зуба в процессе прорезывания и окклюзии (внешняя поверхность и поперечные срезы); B – исследование черепно-лицевой области мыши с регенерированным зубом

Процесс остеогенеза (восстановления костной ткани в области пересадки) проистекал согласованно с развитием корневых структур биоинженерного зуба, так что у экспланта имелось достаточно периодонтального пространства для роста (Рис. 5, 7).

Строение и свойства новых (регенерированных) зубов, как показали ученые в своей публикации, ни чем не отличаются от нормальных, за исключением небольших отклонений в геометрии коронки:

  • сформирована правильная структура, состоящая из эмали, амелобластов, дентина, одонтобластов, пульпы, альвеолярной кости, кровеносных сосудов;
  • корень окружен адекватными периодонтальными связками (ПДС);
  • морфологически коронка зуба имеет сложное многобугорковое строение, однако несколько меньший размер, поскольку в настоящий момент, используя метод клеточных манипуляций in vitro, регулировать ширину коронки и положение бугров и бороздок друг относительно друга не представляется возможным.

Для дифференциации клеток регенерированного зуба применялась методика трансплантации GFP-модифицированного зубного зачатка. GFP (green fluorescent protein) – зеленый флюоресцентный белок – позволяет видеть, куда именно мигрировали клетки экспланта, и отслеживать процесс интеграции новых тканей. GFP-зубной зачаток конструировался из нормальных эпителиальных клеток и мезенхимальных клеток GFP-трансгенной мыши; был пересажен нетрансгенной особи и своевременно развился в полноценный зуб (Рис. 8).

Рис. 8. Снимок GFP-биоинженерного зуба в ротовой полости взрослой особи мыши

Рис. 9. Флюоресцентный снимок GFP-зуба в сечении

GFP-позитивные мезенхимальные клетки также обнаружены в одонтобластах, пульпе, ПДС и дифференцируются от папиллярных и фолликулярных клеток, соответственно. Эффект флюоресценции наблюдается и в дентинных канальцах (tubules) GFP-позитивных одонтобластов биоинженерного зуба (Рис. 9).

Окклюзионный контакт с нижним зубом-антагонистом физиологичен: поддерживаются правильные вертикальные соотношения между взаимодействующими буграми и бороздками; не происходит избыточного роста коронки или перфорации верхнечелюстного синуса (Рис. 10, 11).

Рис. 10, 11. Интраоральный и микро-КТ снимки окклюзионных взаимодействий нормального и биоинженерного зубов

3. Жевательная функция

Способность выдерживать жевательные нагрузки является важнейшим показателем функциональности зубов. Для определения прочностных характеристик как эмали, так и дентина биоинженерного зуба были проведены измерительные тесты с использованием специального прибора (Miniload Hardness Tester, Mitutoyo).

Рис. 12. Оценка прочности. Образцы эмали и дентина биоинженерного зуба (11 недель после трансплантации) сравнивались с аналогичными образцами нормального зуба (3 и 9 недель)

Результаты экспериментов свидетельствуют, что по устойчивости к нагрузкам регенерированный зуб не уступает собственным зубам мыши и способен выполнять полноценную жевательную функцию.

4. Реакция на механический стресс

Полноценный восстановленный зуб должен функционировать согласованно и в кооперации с окружающими тканями ротовой полости и челюстно-лицевого региона в целом через систему периодонтальных связок. Гистологический анализ ПДС биоинженерного зуба (Рис. 5) демонстрирует позитивную связь этого зуба с альвеолярным отростком и дает основания полагать, что данный зуб может реагировать на механический стресс так же как и в гармонии с собственными зубами животного-реципиента.

В настоящем исследовании в качестве фактора механического стресса выступает экспериментальное ортодонтическое лечение, при котором никель-титановая дуга диаметром 0.012 дюймов (VIM-NT, Oralcare Co.) использовалась для перемещения зубов в буккальном направлении (Рис. 13).

Рис. 13. Гистологический анализ (ГЭ окрашивание) поперечных срезов корня нормального и биоинженерного зубов на 0 (слева), 6 (в центре) и 17 (справа) день экспериментального движения зубов

Удалось индуцировать и проанализировать ремоделирование костной альвеолы как ответ ПДС на движение зубов (Рис. 14 a-b). Локализация остеокластов, резорбирующих костную ткань, и остеобластов, необходимых для ее формирования, наблюдалась в областях сжатия и растяжения, соответственно (Рис. 14, 15).

Рис. 14. Гистологический анализ (ГЭ окрашивание) поперечных срезов корня нормального (a) и биоинженерного зубов (b) при экспериментальном ортодонтическом лечении. Области растяжения (T) и сжатия (C) в ПДС показаны с большим увеличением по центру и снизу, соответственно

Рис. 15. Анализ корня биоинженерного зуба на формирование кости с помощью fluorescent double-labeling experiment. При большем увеличении показана область растяжения с меченными остеобластами

Полученные результаты подтверждают, что ПДС биоинженерного зуба способствует успешной перестройке костной ткани посредством правильной локализации остеокластов и остеобластов при реакции на механический стресс.

5. Чувствительность нервных тканей

Способность воспринимать болевые импульсы и передавать информацию в центральную нервную систему является ключевым фактором в защите организма от неблагоприятных воздействий внешней среды. Ранее этой группой ученых было показано, что внутри экспланта формируется нервная ткань, а в ПДС восстанавливается сосудисто-нервный пучок. В текущем же исследовании оценивалась реактивность нервных волокон пульпы и ПДС по отношению к внешним раздражителям.

Для проверки уровня болевой чувствительности биоинженерного зуба и определения путей передачи нервных импульсов использовалась холодовая стимуляция обнаженной пульпы (Рис. 16). Методика заключалась с следующем. Пульпарная камера зуба (регенерированного или контрольного нормального первого моляра) вскрывалась с помощью стоматологической установки (Shofu Inc.), укомплектованной алмазными борами, под глубокой анестезией. Для стимумяции пульпы к полученной полости прикладывался лед. Серия экспериментов доказала, что при воздействии на зуб мышь чувствует боль, а уровень чувствительности биоинженерного зуба и способность к предаче сигналов соответствует естественному.

Рис. 16. Болевая чувствительность. Иммуногистохимический анализ нервных волокон в пульпе и ПДС нормального и биоинженерного зуба с использованием специфичных антител

Эти данные показывают, что волокна, иннервирующие пульпу и ПДС биоинженерного зуба, имеют адекватный персептивный потенциал к болевым воздействиям и могут передавать информацию в ЦНС (medullary dorsal horn).

Заключение

И, хотя предстоит решить еще некоторые проблемы – научиться контролировать морфологию, общий размер, скорость роста зубов, – успех эксперимента открывает новые возможности в области репродуктивной медицины, поскольку технология применима и к человеку.

Как говорят исследователи, их работа обеспечивает если не получение новых зубов в стоматологических клиниках, то как минимум лабораторную модель для дальнейших поисков методики. Кроме того, прогресс в области регенеративной медицины позволяет надеяться, что в будущем станет возможным выращивать не только зубы.

«Конечная цель всех исследований в области регенеративной медицины – создание полностью развитых правильно работающих биоинженерных органов, которые заменят испорченные травмой, болезнью или старением», – поясняет Takashi Tsuji.

©По материалам: www.pnas.org/content/early/2009/07/31/0902944106; www.pnas.org/content/early/2009/07/31/0902944106/suppl/DCSupplemental


Возврат к списку